гексамитоз у скалярии

by гексамитоз у скалярии

Растровая электронная микроскопия жгутиконосца Spironucleus vortens, взятого с головы дискуса. Это главный, подтвержденный возбудитель гексамитоза у тропических аквариумных рыб. Увеличение в 3500 раз. Масштаб 5 мкм (фото — www.int-res.com/articles/dao/45/d045p197.pdf) По ссылке имеются другие фотографии с обозначением отдельных органелл

Дипломонады (подотряд Diplomonadida, семейство Hexamitidae) являются аэротолерантными анаэробными жгутиконосцами, которые имеют двойной набор органелл. К дипломонадам относятся роды Hexamita, Giardia и Spironucleus [Lloyd, Williams, 2014].

Это распространенные комменсальные и, в ряде случаев, паразитические организмы желудочно-кишечного тракта. Многие аспекты инфекции плохо изучены, включая специфичность хозяина, географическое распространение, патогенность отдельных видов. Кроме того, при определении родов и видов возникает серьезная путаница. Хотя в старой литературе докладывалось о представителях родов Hexamita, Octomitus и Spironucleus, как паразитов рыб, последние исследования свидетельствуют, что у рыб присутствуют лишь жгутиконосцы рода Spironucleus. Это открытие стало возможным, благодаря распространению метода просвечивающей электронной микроскопии, которая позволила рассмотреть тонкие, ультраструктурные особенности строения жгутиконосцев. До недавнего времени, малые размеры паразитов 10-20 мкм, препятствовали их точной идентификации.

Содержание

ВведениеСреда обитанияЗаражение и распространение гексамитозаПричины вспышки инфекцииСимптомы гексамитозаДиагностикаАутопсияГексамитоз у цихлид и других видов рыбКак лечить гексамитоз у рыб?

Введение

Не вдаваясь в детали строения клетки Дипломонад (с которыми читатель может ознакомиться самостоятельно — Poynton, Sterud, 2002), отмечу интересные моменты, затронутые авторами данной статьи:— определение вида Дипломонад (Diplomonadina), семейства Hexamitidae невозможно без изучения ультраструктурных особенностей клетки. Необходима просвечивающая электронная микроскопия (TEM);— все современные работы с использованием технологии TEM обнаружили у рыб жгутиконосцев рода Spironucleus, но не Hexamita. Т.е. подтверждены случаи заражения рыб только представителями рода Spironucleus.

Схематичная иллюстрация строения Дипломонад семейства Hexamitidae. У родов Hexamita и Spironucleus имеются пакеты жгутиков в месте их схождения, а у Octomitus они отсутствуют. Отличаются размеры и форма двойных ядер клеток, расположение кинетосом у основания жгутиков, а также канал выхода жгутика сзади клетки. Мелкие элементы не показаны для упрощения. Длина жгутиков у реальных Дипломонад гораздо большеЖгутиконосцы Дипломонад, приготовленные различными техниками и рассматриваемые под световым микроскопом.

Рисунок. Жгутиконосцы Дипломонад, приготовленные различными техниками и рассматриваемые под световым микроскопом. (a,b) Свежие образцы сферического и удлиненного трофозоита Spironucleus torosa (интерференционный микроскоп Номарского); (c,d) сырые препараты Spironucleus torosa, окрашенные Протарголом (препарат коллоидного серебра, протеиновое серебро), отмечены V-образная структура на заднем конце клетки [на TEM снимке изображены в виде двух колец микротрубочек, поддерживающих выступ около тела, рекуррентные жгутики проходят около центра клетки]; (e) препарат Spironucleus torosa, окрашенный Протарголом (препарат коллоидного серебра, протеиновое серебро) по методу с фильтрацией, отмечена темная область на заднем конце тела (на TEM снимке изображены как обширная симметричная система микротрубочек, поддерживаемая удлиненной конструкцией пересекающихся ребер на заднем конце тела), бугорок, прохождение рекуррентных жгутиков под поверхностью клетки; (f) неопределенный вид Дипломонад (стрелки) в мазке крови, окрашенном по Лейшман-Гимза, видны ядро и путь рекуррентных жгутиков через клетку; (g) культура S. barkhanus, окрашенные 4′-6-диамино-2-фенилиндолом (DAPI), наблюдение под световым полем и УФ-излучением, ядро выглядит сине-фиолетовым (белое на фотографии); (h) Spironucleus torosa в срезах ткани (полость прямой кишки), окрашенная по Фельгену (реакция Фельгену); (i) Spironucleus torosa в срезах ткани (полость прямой кишки), окрашенная гематоксилином-эозином. Аббревиатуры: (cp) каудальная проекция; (p) бугорок; v – V-образная структура на заднем конце тела (масштаб = 10 мкм).

Среда обитания

Одноклеточные жгутиконосцы могут жить в окружающей среде, особенно, в загрязненной воде и осадке, либо быть паразитами беспозвоночных (моллюсков, ракообразных), рыб, амфибий, птиц, мышей и других млекопитающих. Их основной функцией в среде обитания является переваривание бактерий для получения питательных веществ.

Наиболее известные дипломонады это Лямблии (Giardia), которые чаще всего выступают первопричиной диареи у людей по всему миру. Этот организм также может привести к смерти маленького ребенка или людей с иммунодефицитом. Паразит прикрепляется к верхней стенке кишечника и, размножаясь, начинает выделяться с фекалиями. Он устойчив к дезинфицирующим средствам, например, хлору в плавательном бассейне. Цисты длительное время сохраняются в воде, и проглатывание даже их небольшого числа приводит заражению. У рыб аналогичным образом происходит заражения другим жгутиконосцем Spironucleus. Он инфицирует Арктического гольца, форель, дикую и культурную рыбу, других тропические аквариумные виды, мышей и птиц.

Успешный контроль инфекции зависит от понимания биохимических различий между возбудителем и его хозяином, в частности, формирования стенки цист. Дипломонады предпочитают среду с низким содержанием кислорода, они слабо защищены от воздействия воздуха. Таким образом, введение окислителей (озона, активного форм хлора, перекисей) в воду поможет бороться с ними [Lloyd, Williams, 2014].

Заражение и распространение гексамитоза

Возбудитель гексамитоза инфицирует диких и культурных рыб, в том числе, аквариумных цихлид (дискусов, скалярий, астронотусов). Паразит селится в начале кишечника, сразу после желудка.

Скорее всего, жгутиконосцы переносятся горизонтально. Цисты или трофозоиты (вегетативная стадия развития) попадают в организм с водой, загрязненной фекалиями. Жгутики позволяют паразиту достигать верхнего отдела кишечника. В кишечном тракте дипломонады свободно перемещаются в просвете и каловых массах.

Время генерации жгутиконосца составляет 24 часа. С кровью паразит проникает в другие части организма, и его популяция возрастает.

Помимо заражения внутренних органов, не исключается заражение покровов тела, появление язв и эрозя боковой линии.

Среди пресноводных аквариумных рыб особенно восприимчивы к возбудителю гексамитоза Окунеобразные (цихлиды). Реже заболевают Карповые – кои и золотые рыбки.

Стоит отметить, что в норме возбудитель гексамитоза часто в незначительном количестве обнаруживается в рыбе. Основываясь на доступных данных, можно предположить, что S. vortens, признанный возбудитель гексамитоза цихлид, находится в промежуточном положении между организмом комменсалом и оппортунистическим паразитом. Например, здоровые скалярии часто имеют в кишечнике этого патогена, однако системная инфекция не развивается. Более того, в язвах при дырочной болезни часто находятся бактерии. Т.е. жгутиконосцы могут опосредованно скапливаться в язвах, питаясь этими бактериями, а не вызывать возникновение самих повреждений [www.biomedcentral.com/1471-2180/8/71].

Причины вспышки инфекции

Быстрое размножение дипломонад и вспышку гексамитоза запускают несколько факторов:1. Плохое качество воды, низкое содержание кислорода и много застойных анаэробных зон в резервуаре;2. Неадекватный рацион питания, резкая смена корма;3. Высокая плотность посадки и содержание рыб различного размера вместе;4. Стресс от манипуляций, транспортировка.

Симптомы гексамитоза

К заражению наиболее восприимчивы слабые и находящиеся в стрессе особи. При гексамитозе рыба теряет аппетит и вес. Она забивается в укромные места, прекращает нормально передвигаться. Окраска темнеет, голова становится светлее остальной части тела. Часто, вследствие истощения, голова рыбы выглядит крупнее её тела (так называемая, рыба «булавочная головка»).

Внешние проявления гексамитоза у астронотуса (Astronotus ocellatus) (mishka, www.oscarfishlover.com/forum)Проявления гексамитоза у цихлиды Фловерн Хорна (Alamy, practicalfishkeeping.co.uk)

Внешние проявления болезни именуются «дырчатой болезнью». Из жабр, рта, язв, головы и ануса рыбы выделяется беловатая слизь. Спустя 48 часов, глаза обволакиваются беловатым налетом. Через несколько дней особи с катарактой теряют зрение. На конечной стадии течения гексамитоза рыбы сталкиваются с недостатком кислорода, их жабры наполнены кровью так, что перенос кислорода в другие части тела затруднен. Особи плавают к поверхности воды, а затем возвращаются на дно. Перемещения нескоординированы.

Спустя 14-16 дней, в отсутствие лечения, заболевшие обычно погибают. На всех стадиях гексамитоза зараженные особи выделяют паразитов в воду и распространяют инфекцию. По этой причине рыбоводу необходимо мыть руки после работы с больными.

Возможно хроническое течение гексамитоза. Оно часто отмечается у культурной рыбы весной и осенью. Смертность среди них слегка выше, чем у здоровых рыб, однако из-за длительного периода культивирования потери могут быть существенными [Tojo, Santamarina, 1998].

Диагностика

Точная диагностика гексамитоза проводится посредством микроскопического исследования давленых препаратов кишечника (увеличение 200-400х), либо фекалий. Жгутиконосцы двигаются быстро и беспорядочно. Их легко заметить в области отслоения слизистой оболочки и при серьезном заражении [Sahandi, Hajimoradloo, 2011].

У живых особей после проведения наркотизации, легким надавливанием на брюшко, выдавливают каловые массы из кишечника. Образец наносят на предметное стекло и добавляют три капли воды. Накрывают покровным стеклом и рассматривают под микроскопом (400х).

Степень инвазии паразита может быть оценена по следующей шкале [Tojo, Santamarina, 1998]:Ноль (-) — на площади стекла 24х32 мм отсутствует возбудитель гексамитоза;Минимальная (+/-) — на площади стекла 24х32 мм обнаружен только один паразит;Низкая (+) — обнаружено более одного паразита во всем препарате (24х32 мм), в поле микроскопирования менее 10 особей;Умеренная (++) – в поле микроскопирования 10-50 особей;Высокая (+++) — в поле микроскопирования >50 особей

Аутопсия

У мертвых рыб берут область кишечника сразу после желудка. У больных особей этот отдел имеет ярко-желтую окраску (из-за выделения желчи). Готовят давленые препараты кишечника и рассматривают под микроскопом.

Плавники рыб темные и в основании имеют кровоизлияния. Чешуя покрыта беловатой, желтоватой слизью. Заражению подвергаются кишечник, печень, селезенка, плавательный пузырь, сердце, кожа и плавники. Однако гистологические изменения во внутренних органах отмечаются лишь у некоторых видов.  Так у скалярий образуются гранулемы в печени, происходит инфильтрация макрофагов в селезенке и лимфоцитов в кишечнике. У астронотусов и мбун этого не наблюдается [Suchanya Mankhakhet et al., 2012].

Перед смертью происходят многочисленные внутренние кровоизлияния.

Ткань печени (1), селезенки (2) и кишечника (3) скалярии, зараженной гексамитозом. Окрашивание гематоксилином и эозином. Масштаб 50 и 100 мкм. Gr — гранулема, M — макрофаги, * — область воспаления, инфильтрат лимфоцитов и подслизистая оболочка в кишечнике (Suchanya Mankhakhet et al., 2012)

Для идентификации возбудителя гексамитоза при аутопсии кишечника, рекомендуется предварительно оставить рыб без корма.

Стоит отметить, что у рыбок, тяжело пораженных возбудителем гексамитоза (многочисленные паразиты в пилорическом привратнике желудка и кишечнике), по-прежнему могут отсутствовать повреждения слизистого покрова кожи и внешние признаки инвазии в эпителий [Tojo, Santamarina, 1998].

Гексамитоз у цихлид и других видов рыб

На фото гексамитоз у скалярии (Pterophyllum scalare) (advancedaquariumconcepts.com/hole-in-the-head-discus-oscars.html)

Получены достоверные результаты заражения скалярий, астронотусов и мбуны видом Spironucleus vortens. Удалось получить культуру паразита у скалярии. В свежем препарате он был активен и быстро крутился вокруг продольной оси. Трофозоиты имели грушевидную, овальную форму, 9.0-16.0 мкм (среднее 12.86 мкм) в длину и 3.0-10.0 мкм (среднее 6.52 мкм) в ширину. Они несли S-образное ядро и 8 жгутиков (6 передних и 2 задних) [Suchanya Mankhakhet et al., 2012].

Искусственное заражение скалярий гексамитозом приводило к гибели 13.33-86.67% особей в течение 14 дней. Клинические проявления болезни были схожи с аналогичным заболеванием диких особей, однако некоторые аквариумные экземпляры умирали без каких-либо клинических симптомов.

В экспериментах с искусственным заражением гуппи, меченосцев, золотой рыбки и пецилий продемонстрирована устойчивость этих видов к Spironucleus vortens. У петушков (Betta splenders) возбудитель гексамитоза не обнаружен [Suchanya Mankhakhet et al., 2012].

В другой работе было показано, что гексамитоз северумов, скалярий, нильской тиляпии также вызывают жгутиконосцы вида Spironucleus vortens. Паразит был выделен из почек, печени, селезенки и язв на голове рыб [Paull, Matthews, 2001].

С другой стороны, холодноводные культурные рыбы, Атлантический лосось, Арктический голец страдают от вида Spironucleus barkhanus [Guo, Woo, 2004], а радужная форель – от вида Spironucleus salmonis [Fard et al., 2007]. Течение гексамитоза у них имеет две фазы – кровяную и тканевую.

Таким образом, возбудители гексамитоза многочисленны и демонстрируют четкую видовую специфичность к хозяевам.

Как лечить гексамитоз у рыб?

Эффективность в отношении внутренних паразитов простейших, в том числе, жгутиконосцев и инфузорий, показало лишь оральное введение лекарственных препаратов.

Интересное исследование (правда с другим видом жгутиконосца — Ichthyobodo necator), с включением обширного списка препаратов производных и не производных нитроимидазола, провели в 1998 году Тоджо и Сантамарина из испанского университета Сантьяго-де-Компостела, кафедры Микробиологии и Паразитоголии [Tojo, Santamarina, 1998].

В своей работе они использовали протоколы введения веществ в корм в следующих дозах:— доза препаратов не производных нитроимидазола – 40 г/кг корма в течение 10 дней.— доза препаратов производных нитроимидазола – 2-5 г/кг корма в течение 2 дней.

В опытную и контрольную группы входили по 20 особей радужной форели (Oncorhynchus mykiss). Контрольная группа питалась обычным кормом.

По окончании курса приема лекарства, фекалии рыб подвергались микроскопическому исследованию. Активность препаратов оценивалась по оставшемуся количеству паразитов Ichthyobodo necator (жгутиконосцы) (классификация приведена выше). Полученные результаты приведены в таблице.

Таблица 1. Результаты исследования активности препаратов не производных нитроимидазола, признанных неэффективными. Для каждого препарата (во всех случаях вносили 40 г/кг корма в течение 10 дней) изучалась интенсивность инфекции, спустя 24 часа после обработки (24 часа + 10 дня). Интенсивность: +++ — высокая, ++ — умеренная, + — слабая, -/+ — минимальная, — — нулевая (пояснения в тексте). nd — интенсивность не определена, D — особь погибла в ходе эксперимента [Tojo, Santamarina, 1998]Таблица 2. Результаты исследования активности препаратов не производных нитроимидазола, признанных эффективными. Для каждого препарата (во всех случаях вносили 40 г/кг корма в течение 2 дней) изучалась интенсивность инфекции, спустя 24 часа после обработки (24 часа + 2 дня). Интенсивность: +++ — высокая, ++ — умеренная, + — слабая, -/+ — минимальная, — — нулевая (пояснения в тексте). nd — интенсивность не определена, D — особь погибла в ходе эксперимента [Tojo, Santamarina, 1998]Таблица 3. Результаты исследования активности 4 препаратов производных нитроимидазола. Для каждого препарата (вносили 2 или 5 г/кг корма в течение первых 2 дней из 10 дней экспериментального периода) изучалась интенсивность инфекции, спустя 24 часа после обработки (24 часа + 10 дней). Интенсивность: +++ — высокая, ++ — умеренная, + — слабая, -/+ — минимальная, — — нулевая (пояснения в тексте). nd — интенсивность не определена, D — особь погибла в ходе эксперимента [Tojo, Santamarina, 1998]Высокая эффективность препаратов производных нитроимидазола (метронидазола, диметридазола) была подтверждена в экспериментах с подавлением роста культуры Spironucleus vortens в условиях in vitro. Минимальная ингибирующая концентрация метронидазола и диметридазола составили 4 мкг/мл (число дипломонад снижалось вдвое за 48 и 24 часов, соответственно).

Сульфат магния (MgSO4) показал низкую эффективность на культуре Spironucleus vortens в условиях in vitro. Лишь в высоких дозах (70 мг/мл) он постепенно снижал число жгутиконосцев (на 12,5% от исходного уровня через 96 часов) [Sangmaneedet, Smith, 1999].

Некоторые авторы предлагают протоколы кормления рыб рационом с добавлением MgSO4 1,5% (в течение 4 дней; Rothenbacher et al., 1975) или 3% (в течение 3 дней; Hamdi Ogut, Abdurrezzak Akyol, 2005). Тем не менее, для борьбы с возбудителем гексамитоза, вероятно, эта соль малоэффективна. По крайней мере, найти исследования, в которых изучалась эффективность MgSO4 при оральном введении больным рыбам, не удалось.

К протоколам лечения, которые предусматривают внесение препаратов в воду резервуара, стоит относиться с осторожностью. Дело в том, что во время вспышки инфекции основная масса жгутиконосцев локализована в кишечнике больных рыб, поэтому добавление препаратов в воду снижает вероятность заражения, но не ликвидирует источник инфекции.——David Lloyd, Catrin F. Williams. Comparative biochemistry of Giardia, Hexamita and Spironucleus: Enigmatic diplomonads. Molecular and Biochemical Parasitology. 197 (1–2) : 43–49. 2014J.L. Tojo, Teresa Santamarina. Oral pharmacological treatments for parasitic diseases of rainbow trout Oncorhynchus mykiss. III: Ichthyobodo necator. Diseases of Aquatic Organisms. 33(3) : 195-9. 1998Poynton S.L., Sterud E. Guidelines for species descriptions of diplomonad flagellates from fish. Journal of Fish Diseases. 25 (1) : 15–31, 2002Fard M.R., Jørgensen A., Sterud E., Bleiss W., Poynton S.L. Ultrastructure and molecular diagnosis of Spironucleus salmonis (Diplomonadida) from rainbow trout Oncorhynchus mykiss in Germany. Dis Aquat Organ. 75 (1) : 37-50. 2007Guo F.C., Woo P.T. Detection and quantification of Spironucleus barkhanus in experimentally infected Atlantic salmon Salmo salar. Dis Aquat Organ. 61 (1-2) : 175-8. 2004Paull G.C., Matthews R.A. Spironucleus vortens, a possible cause of hole-in-the-head disease in cichlids. Dis Aquat Organ. 45 (3) : 197-202. 2001Suchanya Mankhakhet, Naraid Suanyuk, Chutima Tantikitti, Wutiporn Phromkunthong, Suphada Kiriratnikom, Theerawoot Lerssutthichawal, Boonkob Viriyapongsutee. Diplomonad flagellates of some ornamental fish cultured in Thailand. Songklanakarin Journal of Science & Technology. 34 (5) : 487-494. 2012Javad Sahandi, Abdolmajid Hajimoradloo. Hole-in-head disease: New method of treatment in flower horn ornamental fish. Human & Veterinary Medicine, 3 (2), 2011Sangmaneedet S, Smith S.A. Efficacy of various chemotherapeutic agents on the growth of Spironucleus vortens, an intestinal parasite of the freshwater angelfish. Dis Aquat Organ. 38 (1) : 47-52. 1999Rothenbacher H.J, Boh M. Hexamita: Pathogenicity and therapy. Fischund Umwelt 1, 13 — 23, 1975Hamdi Ogut, Abdurrezzak Akyol. Prevalence And Intensity Of Hexamita Salmonis In Rainbow Trout Farms In The Southeastern Black Sea And Their Relationship To Environmental Factors. The Israeli Journal of Aquaculture – Bamidgeh. 57 (2) : 97-104. 2005

Гексамитоз у цихлид и других видов рыб На фото гексамитоз у скалярии (Pterophyllum scalare) гексамитоз у скалярии